Articles

Nowe biomarkery smółki prenatalnej ekspozycji na metamfetaminę zwiększają identyfikację dotkniętych noworodków | Web Root

Niemowlęta prenatalnie narażone na metamfetaminę (MAMP)10 są bardziej prawdopodobne, że są małe w wieku ciążowym, mają niższą masę urodzeniową (1) i doświadczają zwiększonego stresu fizjologicznego (2). Identyfikacja niemowląt narażonych na MAMP jest niezbędna, nie tylko w celu ustanowienia interwencji medycznych, behawioralnych i społecznych, ale także w celu scharakteryzowania długoterminowych efektów. W badaniu rozwoju dziecka, środowiska i stylu życia (idealnego), 71.0% zakażonych noworodków zidentyfikowano tylko poprzez ujawnienie matki podczas wywiadu poporodowego, a nie na podstawie pozytywnych wyników testów smołowych; 25,2% zidentyfikowano na podstawie raportu własnego i pozytywnych wyników smołowych, a 3,8% zidentyfikowano tylko na podstawie analizy smołowej (3).

zaproponowaliśmy możliwe wyjaśnienia niskiej szybkości wykrywania smółki. Po pierwsze, większość kobiet w idealnym badaniu przerwała stosowanie MAMP w pierwszym lub drugim trymestrze (3, 4). Smoła zaczyna się formować w drugim trymestrze, a dane z naszego laboratorium i innych sugerują, że ekspozycja na lek w drugim trymestrze jest słabo odzwierciedlona w smołce (5, 6). Istotnie, próbki smółki były bardziej narażone na pozytywny wynik testu, gdy stosowanie leku MAMP przez matkę kontynuowano w trzecim trymestrze i przekraczało je raz w tygodniu (3); jednak 54,3% noworodków narażonych w trzecim trymestrze miało smółkę z ujemnym wynikiem amfetaminowym.

po drugie, procedura badania może przyczynić się do niskiej liczby próbek smołowych dodatnich amfetamin. Próbki smółki były początkowo przesiewane metodą immunoenzymatycznego testu (EMIT) przy odcięciu 500 ng/g amfetaminy. Jeśli wyniki były pozytywne, obecność MAMP i amfetaminy (AMP) została potwierdzona przez GC-MS.możliwe jest, że niektóre próbki smółki zawierały biomarkery MAMP i/lub AMP w stężeniach poniżej odcięcia testu immunologicznego. Poprzez bezpośrednią analizę tych próbek za pomocą procedury chromatograficznej z ulepszonymi limitami wykrywalności, możemy oszacować częstość występowania fałszywie ujemnych wyników testów immunologicznych w idealnej populacji.

ostatecznie nie potwierdzono prawie 70% pozytywnych wyników badań przesiewowych amfetamin. Emitują testy ukierunkowane na MAMP / AMP reagują krzyżowo z innymi aminami sympatykomimetycznymi, w tym składnikami leków dostępnych bez recepty na zimno, fenetyloaminami i innymi nielegalnymi amfetaminami. Dodatkowo, substancje endogenne, inne związki egzogenne lub mniejsze metabolity MAMP / AMP w smółce mogą dawać pozytywne wyniki testów immunologicznych. Wcześniejsze badania nad kokainą i kannabinoidami zidentyfikowały stosunkowo niewielkie produkty metaboliczne dorosłych, które występują w smółce w wyższych proporcjach i które wyraźnie reagują krzyżowo w testach immunologicznych (7, 8).

słabe wykrycie narażenia na MAMP skłoniło Nasze laboratorium do zbadania 3 potencjalnych alternatywnych biomarkerów smołowych prenatalnej ekspozycji na MAMP: P-hydroksymetamfetamina (POHHAMP), P-hydroksyamfetamina (POHAMP) i norefedryna (NOREPH) (Fig. 1). pOHMAMP i NOREPH stwierdzono odpowiednio w 86,0% i 25,6% próbek smółki MAMP-dodatniej, które nie zostały pobrane w ramach badania idealnego; stężenie pOHAMP było zawsze poniżej granicy oznaczalności (LOQ) (9). Nadal jednak nie było jasne, czy te nowe biomarkery zwiększą identyfikację niemowląt narażonych na MAMP, gdy MAMP i AMP nie były obecne. Głównym celem tego badania było ustalenie, czy nowe metabolity MAMP pohkamp, POHAMP i NOREPH mogą poprawić identyfikację noworodków narażonych na MAMP i AMP.

szlak metaboliczny MAMP, AMP, NOREPH, pOHAMP i pohhamp.

szczegółowy opis idealnego badania został wcześniej opublikowany( 10); instytucjonalna Komisja Rewizyjna każdej witryny zatwierdziła badanie. Po udzieleniu świadomej, pisemnej zgody, matki zostały przesłuchane na temat ilości i częstotliwości MAMP, Ecstasy (3,4-metylenodioksymetamfetaminy lub MDMA) i konsumpcji AMP podczas ciąży.

smółkę zbierano z pieluch aż do pojawienia się stolca mlecznego. Próbki pozostawały w lodówce do nocnego transportu do amerykańskich laboratoriów testujących leki (w Des Plaines, IL) w celu analizy. Syva EMIT II Plus (Dade Behring/Siemens Healthcare Diagnostics) ekrany przeznaczone do badania amfetamin w moczu zastosowano do próbek smołowych po poddaniu ich homogenizacji metanolu i ekstrakcji w fazie stałej. Jeśli próbki miały wyniki badań przesiewowych ≥500 ng/g, analiza GC-MS potwierdziła obecność MAMP i AMP (odcięcia 5-ng/g). Wszystkie próbki zostały zamrożone w temperaturze -20 °C.

po analizie próbki smółki zostały wysłane zamrożone do National Institute on Drug Abuse w celu dalszej oceny. Wybrano próbki smołowe z 3 idealnych grup uczestników: a) 48 kobiet, które odmówiły zażywania amfetaminy, ale uzyskały pozytywne wyniki w badaniu smółkowym; b) 62 kobiety, które zgłosiły samo zażywanie amfetaminy, ale uzyskały negatywne wyniki w badaniu smółkowym; oraz c) 22 kobiety, które zgłosiły samo zażywanie amfetaminy i uzyskały pozytywne wyniki w badaniu smółkowym. Reanaliza obejmowała homogenizację metanolu, ekstrakcję w fazie stałej i chromatografię cieczową–tandemową spektrometrię mas (LC-MS/MS) (11, 12). Pierwsze 72 Próbki analizowano pod kątem MAMP, AMP, POHMAMP, POHAMP i NOREPH; a 12.Zastosowano odcięcie 5-ng/g LOQ, z wyjątkiem pOHMAMP, dla którego zastosowano odcięcie 8-ng/g (11). Pozostałe 60 próbek poddano analizie metodą LC-MS/MS z niższymi LOQ dla MAMP (2,5 ng/g), AMP (5 ng/g) i POHM (1 ng/g) (12); pOHAMP i NOREPH zostały wykluczone ze względu na ich niską częstość występowania w początkowym zestawie danych.

SPSS wersja 16.0 Dla Windows (SPSS) i Microsoft Excel zostały wykorzystane do analizy danych i oceny statystycznej. Wartości P <0, 05 uznano za istotne statystycznie.

z 132 próbek, 43 (32 .6%) zawierało jeden lub więcej biomarkerów MAMP w wyniku analizy LC-MS/MS. Większość badanych próbek (62,7%) zawierała MAMP, AMP i POHMAMP; MAMP i AMP znaleziono tylko w 16,3% próbek. MAMP i pohmap stwierdzono u 4,7%, a MAMP obserwowano tylko u 2,3%. Zaskakująco, 6 (14,0%) z 43 próbek było dodatnich dla POHMAP bez pozytywnych wyników dla MAMP lub AMP. pOHAMP i NOREPH zostały zidentyfikowane w kilku próbkach i tylko wtedy, gdy były obecne również MAMP i AMP.

48 kobiet, które odmówiły stosowania amfetaminy w czasie ciąży, miało próbki smółki, które oceniano jako pozytywne. Wyniki dla większości próbek smołowych nie zostały potwierdzone w reanalizie LC-MS/ MS; tylko 2 próbki zawierały MAMP, AMP i / lub pOHMAMP, w tym 1 próbka zawierająca 6,2 NG / G MAMP (Tabela 1). Oceniliśmy próbki smółki od noworodków 62 kobiet, które zgłosiły spożycie amfetaminy w czasie ciąży, ale próbki smółki ich niemowląt zostały zbadane jako negatywne; 48 z tych kobiet zaprzestało stosowania amfetaminy w pierwszym lub drugim trymestrze (wczesne narażenie), podczas gdy pozostałe 14 kobiet kontynuowało nadużywanie do trzeciego trymestru (późne narażenie). Dwadzieścia (32.3%) z 62 próbek smółki zawierało jeden lub więcej biomarkerów przekraczających LC-MS/MS LOQ, w tym 6 próbek zawierających tylko pOHMAMP(Tabela 1). Te 6 próbek pochodziło od 2 kobiet, które stosowały amfetaminę w pierwszym i/lub drugim trymestrze oraz 4 kobiet, które kontynuowały stosowanie do trzeciego trymestru. Indywidualne i całkowite stężenia biomarkerów MAMP, AMP i pohhamp w analizie LC-MS / MS były niższe od wartości odcięcia testu immunologicznego w 59 (95,2%) z 62 próbek smołowych, w tym wszystkich próbek od noworodków narażonych na wczesnym etapie ciąży. Wśród 22 kobiet z pozytywnym raportem własnym i pozytywnymi wynikami badań smołowych, wyniki wszystkich próbek smołowych oprócz 1 zostały potwierdzone zarówno przez GC-MS, jak i LC-MS/MS (Tabela 1).

Tabela 1

występowanie i stężenia amfetamin i metabolitów w smółce oznaczane metodą LC-MS / MS.

analizowane próbki, N dodatnie, N (%) Mediana, ng / g zakres, ng / g
ujemny samokontrola matki i pozytywny wynik testu immunologicznego (n = 48)
MAMP 48 2 (4.2) 2479 6.2–4952
AMP 48 1 (2.1) 1106
pOHMAMP 48 1 (2.1) 28.9
pOHAMP 19 0 (0.0)
NOREPH 19 1 (5.3) 31.4
dodatni wynik samokontroli matki i wynik ujemny w badaniu immunologicznym (n = 62)
MAMP 62 14 (22.6) 29.3 5.1–10370
AMP 62 12 (19.4) 23.1 5.1–1600
pOHMAMP 62 15 (24.2) 23.0 1.3–435
pOHAMP 34 1 (2.9) 17.1
NOREPH 34 2 (5.9) 26.8 13.7–39.9
dodatni samokontrola matki i pozytywny wynik testu immunologicznego (n = 22)
MAMP 22 21 (95.5) 1455 188-10250
AMP 22 21 (95.5) 285 20.3-1012
pOHMAMP 22 19 (86.4) 140 27.2–402
pOHAMP 19 0
NOREPH 19 8 (42.1) 17.0 14.2–96.9

porównaliśmy obecność pOHMAMP i jego stężenia w próbkach smółki z wzorcami stosowania MAMP u matek i szacowanym wiekiem ciążowym w celu zbadania czynników mogących wpływać na usposobienie pohmampa. pOHMAMP był wykrywany częściej i występował w wyższych stężeniach (mediana, 138 ng/g; Zakres, 3,5–345 ng/g), gdy ekspozycja była kontynuowana do trzeciego trymestru (23 z 34 noworodków, 67,6%) niż w przypadku zaprzestania zażywania narkotyków wcześniej (11 z 50 noworodków, 22,0%; mediana, 23,0 ng/g; Zakres, 1,2–343 ng/g). Częstość ekspozycji nie była związana z obecnością lub stężeniem pOHMAMP. Młodszy wiek matki i zmniejszona masa urodzeniowa były związane z obecnością pOHMAMP, ale nie były liniowo skorelowane ze stężeniami w smółce; podobne wyniki zaobserwowano dla MAMP i AMP(patrz Tabela 1 w suplemencie danych dołączonym do wersji online tego krótkiego komunikatu pod adresem http://www.clinchem.org/content/vol56/issue5).

monitorowanie pOHAMP i NOREPH nie zwiększyło identyfikacji dotkniętych niemowląt; te anality stwierdzono tylko w połączeniu z MAMP i AMP. Jednak sześć kolejnych noworodków, z których wszystkie miały negatywne wyniki badań przesiewowych, zostało zidentyfikowanych jedynie na podstawie obecności pohmampa w smółce. Dalsze badania są konieczne w celu określenia tożsamości innych biomarkerów reaktywnych w badaniu immunologicznym i zmniejszenia reaktywności krzyżowej testu immunologicznego z innymi endogennymi i egzogennymi analitami. Moore et al. zidentyfikowano dużą część próbek smółki, które uzyskały wynik dodatni w teście immunologicznym amfetaminy, jako wykazujące wynik dodatni na obecność pseudoefedryny lub fenyloetyloaminy (13).

prawie 1 na 3 noworodków, u których samoistnie zgłaszano stosowanie MAMP u matki, ale wyniki testu immunologicznego z ujemnym wynikiem smółki miały dodatnie wyniki LC-MS / MS, chociaż większość stężeń była niska. Zmniejszenie stężenia odcięcia testu immunologicznego mogło zidentyfikować więcej próbek prawdziwie dodatnich, ale biorąc pod uwagę już niski wskaźnik potwierdzeń, prawdopodobnie zidentyfikowałoby również dodatkowe niepotwierdzone próbki. Marin i in. bezpośrednio porównano test emisji (odcięcie 200-ng/g) z testem ELISA (odcięcie 20-ng/g) (14). Pomimo niższego odcięcia ELISA, oba testy immunologiczne wykazały równoważne wskaźniki fałszywie dodatnie w porównaniu z wynikami chromatograficznych testów potwierdzających. W przypadkach samokontroli MAMP ze strony matki, może być wskazane bezpośrednie przeprowadzenie badań chromatograficznych lub włączenie noworodków do grupy narażonej na MAMP na podstawie pozytywnych wyników w testach smołowych lub samookontroli ze strony matki, tak jak miało to miejsce w badaniu IDEAL.

pohmap był częściej obecny, gdy konsumpcja amfetamin przez matki trwała do trzeciego trymestru, ale na jego obecność nie miała wpływu częstotliwość stosowania MAMP. Nadal nie jest jasne, jakie inne czynniki mogą przyczynić się do powstania i/lub usposobienia pohmampu. MAMP jest biotransformowany do AMP i pohmap przez CYP2D6 (15), który ma >70 wariantów allelicznych (16) i zwiększoną aktywność w czasie ciąży (17); farmakogenomika uczestniczek nie jest znana. W moczu przeważają niezmienione stężenia MAMP, AMP i pohmap (18, 19), podobnie jak w smółce. Wątroba płodu wytwarza CYP2D6 we wczesnym okresie ciąży (20), ale jego metaboliczna wydajność dla MAMP jest nieznana. Dodatkowe badania są niezbędne do wyjaśnienia, które czynniki wpływają na dyspozycję biomarkera w smółce.

podsumowując, sam pOHMAMP zidentyfikował dodatkowe noworodki narażone na amfetaminę, podczas gdy pOHAMP i NOREPH nie wykryli. Częstość potwierdzeń testu immunologicznego amfetaminy-dodatniego smółki nie wzrosła. Dalsze badania są niezbędne do identyfikacji reaktywnych gatunków krzyżowych, które przyczyniają się do niepotwierdzonych pozytywnych wyników w testach immunologicznych smółki.