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I nuovi biomarcatori del meconio dell'esposizione prenatale alla metanfetamina Aumentano l'identificazione dei neonati affetti | Web Root

I neonati esposti prenatalmente alla metanfetamina (MAMP)10 hanno maggiori probabilità di essere piccoli per la loro età gestazionale, hanno pesi alla nascita inferiori (1) e sperimentano un aumento dello stress fisiologico (2). Identificare i neonati esposti a MAMP è imperativo, non solo per stabilire interventi medici, comportamentali e sociali, ma anche per caratterizzare gli effetti a lungo termine. Nello studio dello sviluppo infantile, dell’ambiente e dello stile di vita (IDEALE), 71.Lo 0% dei neonati affetti è stato identificato solo attraverso la divulgazione materna durante l’intervista postpartum, piuttosto che da risultati positivi nei test del meconio; il 25,2% è stato identificato da auto-relazione e risultati positivi del meconio e il 3,8% è stato identificato solo dall’analisi del meconio (3).

Abbiamo proposto possibili spiegazioni per il basso tasso di rilevamento nel meconio. In primo luogo, la maggior parte delle donne nello studio IDEALE ha interrotto l’uso di MAMP nel primo o nel secondo trimestre (3, 4). Il meconio inizia a formarsi nel secondo trimestre e i dati del nostro laboratorio e di altri suggeriscono che l’esposizione al farmaco del secondo trimestre è scarsamente riflessa nel meconio (5, 6). In effetti, i campioni di meconio avevano maggiori probabilità di essere positivi al test quando l’uso di droghe materne MAMP continuava nel terzo trimestre e superava una volta alla settimana (3); tuttavia, il 54,3% dei neonati esposti durante il terzo trimestre aveva meconio negativo alle anfetamine.

In secondo luogo, la procedura di prova può contribuire al basso numero di campioni di meconio positivi alle anfetamine. I campioni di meconio sono stati inizialmente sottoposti a screening con la tecnica del dosaggio immunoenzimatico moltiplicato (EMIT) a un taglio di 500 ng/g di anfetamine. Se i risultati sono stati positivi, la presenza di MAMP e amphetamine (AMP) è stata confermata da GC-MS. È possibile che alcuni campioni di meconio contenessero biomarcatori MAMP e/o AMP a concentrazioni inferiori al taglio immunologico. Analizzando direttamente questi campioni con una procedura cromatografica con limiti di rilevamento migliorati, potremmo stimare la prevalenza di risultati immunologici falsi negativi all’interno della popolazione IDEALE.

Infine, quasi il 70% dei risultati positivi negli schermi delle anfetamine non è stato confermato. EMETTONO saggi mirati MAMP / AMP cross-react con altre ammine simpaticomimetici, compresi i componenti freddo-medicazione over-the-counter, fenetilammine, e altre anfetamine illecite. Inoltre, sostanze endogene, altri composti esogeni o metaboliti minori MAMP/AMP nel meconio possono produrre risultati immunologici positivi. Precedenti ricerche su cocaina e cannabinoidi hanno identificato prodotti metabolici adulti relativamente minori che si verificano nel meconio in proporzioni più elevate e che reagiscono marcatamente in saggi immunologici (7, 8).

La scarsa rilevazione dell’esposizione a MAMP ha spinto il nostro laboratorio a studiare 3 potenziali biomarcatori alternativi di meconio dell’esposizione prenatale a MAMP: p-idrossimetamfetamina (pOHMAMP), p-idrossiamfetamina (pOHAMP) e norefedrina (NOREPH) (Fig. 1). pOHMAMP e NOREPH sono stati trovati rispettivamente nell ‘ 86,0% e nel 25,6% di campioni di meconio MAMP-positivi non raccolti nell’ambito dello studio IDEAL; la concentrazione di pOHAMP era sempre inferiore al limite di quantificazione (LOQ) (9). Non era ancora chiaro, tuttavia, se questi nuovi biomarcatori avrebbero aumentato l’identificazione dei neonati esposti alla MAMP quando MAMP e AMP non erano presenti. Lo scopo principale di questo studio era determinare se i nuovi metaboliti MAMP pOHMAMP, pOHAMP e NOREPH potessero migliorare l’identificazione dei neonati esposti a MAMP e AMP.

Via metabolica di MAMP, AMP, NOREPH, pOHAMP e pOHMAMP.

Una descrizione dettagliata dello studio IDEAL è stata precedentemente pubblicata (10); il comitato di revisione istituzionale di ogni sito ha approvato lo studio. Dopo aver fornito il consenso informato e scritto, le madri sono state intervistate sulla quantità e la frequenza di MAMP, Ecstasy (3,4-methylenedioxymethamphetamine, o MDMA) e consumo di AMP durante la gravidanza.

Il meconio è stato raccolto dai pannolini fino alla comparsa delle feci di latte. I campioni sono rimasti refrigerati fino al trasporto notturno ai laboratori di test antidroga degli Stati Uniti (a Des Plaines, IL) per l’analisi. Gli schermi Syva EMIT II Plus (Dade Behring/Siemens Healthcare Diagnostics) progettati per il test delle anfetamine nelle urine sono stati utilizzati per i campioni di meconio dopo essere stati sottoposti all’omogeneizzazione del metanolo e all’estrazione in fase solida. Se i campioni avevano risultati di screening ≥500 ng / g, l’analisi GC-MS ha confermato la presenza di MAMP e AMP (5-ng/g cutoff). Tutti i campioni sono stati congelati a -20 °C.

Dopo l’analisi, i campioni di meconio sono stati spediti congelati al National Institute on Drug Abuse per ulteriori valutazioni. Sono stati scelti campioni di meconio da 3 gruppi di partecipanti IDEALI: (a) 48 donne che hanno negato l’uso di anfetamine ma hanno avuto risultati positivi nello schermo del meconio; (b) 62 donne che hanno auto-riferito l’uso di anfetamine ma hanno avuto risultati negativi nello schermo del meconio; e (c) 22 donne che hanno auto-riferito l’uso di anfetamine e hanno avuto risultati positivi nello schermo del meconio. La rianalisi comprendeva l’omogeneizzazione del metanolo, l’estrazione in fase solida e l’analisi cromatografica liquida-spettrometria di massa tandem (LC–MS/MS) (11, 12). I primi 72 campioni sono stati analizzati per MAMP, AMP, pOHMAMP, pOHAMP e NOREPH; un 12.5-ng / g LOQ cutoff è stato utilizzato ad eccezione di pOHMAMP, per il quale è stato utilizzato un 8-ng/g cutoff (11). I restanti 60 campioni sono stati analizzati con una procedura LC-MS/MS con LOQS inferiori per MAMP (2,5 ng/g), AMP (5 ng/g) e pOHMAMP (1 ng/g) (12); pOHAMP e NOREPH sono stati esclusi a causa della loro bassa prevalenza nel set di dati iniziale.

SPSS versione 16.0 per Windows (SPSS) e Microsoft Excel sono stati utilizzati per l’analisi dei dati e la valutazione statistica. I valori di P < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Dei 132 campioni di meconio, 43 (32 .6%) conteneva uno o più biomarcatori MAMP mediante analisi LC-MS/MS. La maggior parte dei campioni di test positivi (62,7%) conteneva MAMP, AMP e pOHMAMP; MAMP e AMP sono stati trovati solo nel 16,3% dei campioni. MAMP e pOHMAMP sono stati identificati nel 4,7% e MAMP è stato osservato solo nel 2,3%. Sorprendentemente, 6 (14,0%) su 43 campioni sono risultati positivi per pOHMAMP senza risultati positivi per MAMP o AMP. pOHAMP e NOREPH sono stati identificati in pochi campioni e solo quando erano presenti anche MAMP e AMP.

Le 48 donne che hanno negato qualsiasi uso di anfetamine durante la gravidanza hanno avuto campioni di meconio che sono risultati positivi. I risultati per la maggior parte dei campioni di meconio non sono stati confermati nella rianalisi LC-MS/MS; solo 2 campioni contenevano MAMP, AMP e/o pOHMAMP, incluso 1 campione contenente 6,2 ng/g MAMP (Tabella 1). Abbiamo valutato campioni di meconio dai neonati di 62 donne che hanno riportato il consumo di anfetamine durante la gravidanza, ma i campioni di meconio dei loro bambini sono stati esaminati come negativi; 48 di queste donne hanno interrotto l’uso di anfetamine nel primo o secondo trimestre (esposizione precoce), mentre le restanti 14 donne hanno continuato l’abuso nel terzo trimestre (esposizione tardiva). Venti (32.3%) dei 62 campioni di meconio contenevano uno o più biomarcatori superiori al LOQ LC-MS/MS, inclusi 6 campioni con solo pOHMAMP (Tabella 1). Questi 6 campioni provenivano da 2 donne che hanno usato anfetamine nel primo e / o secondo trimestre e 4 donne che hanno continuato il loro uso nel terzo trimestre. Le concentrazioni di biomarcatori individuali e totali di MAMP, AMP e pOHMAMP mediante analisi LC-MS/MS erano inferiori al cutoff immunologico in 59 (95,2%) di 62 campioni di meconio, inclusi tutti i campioni di neonati esposti all’inizio della gestazione. Tra le 22 donne con un self-report positivo e risultati positivi di screening del meconio, i risultati di tutti tranne 1 dei campioni di meconio sono stati confermati sia da GC-MS che LC-MS/MS (Tabella 1).

Tabella 1

Prevalenza e concentrazioni di anfetamine e metaboliti nel meconio come analizzato da LC-MS / MS.

Campioni analizzati (n Positivo, n (%) Mediana, ng/g Gamma, ng/g
Negativo materna self-report e risultato positivo nel test immunologico schermo (n = 48)
MAMP 48 2 (4.2) 2479 6.2–4952
AMP 48 1 (2.1) 1106
pOHMAMP 48 1 (2.1) 28.9
pOHAMP 19 0 (0.0)
NOREPH 19 1 (5.3) 31.4
Positivo materna self-report e di risultato negativo nel test immunologico schermo (n = 62)
MAMP 62 14 (22.6) 29.3 5.1–10370
AMP 62 12 (19.4) 23.1 5.1–1600
pOHMAMP 62 15 (24.2) 23.0 1.3–435
pOHAMP 34 1 (2.9) 17.1
NOREPH 34 2 (5.9) 26.8 13.7–39.9
Positivo materna self-report e risultato positivo nel test immunologico schermo (n = 22)
MAMP 22 21 (95.5) 1455 188-10250
AMP 22 21 (95.5) 285 20.3-1012
pOHMAMP 22 19 (86.4) 140 27.2–402
pOHAMP 19 0
NOREPH 19 8 (42.1) 17.0 14.2–96.9

Abbiamo confrontato pOHMAMP presenza e le sue concentrazioni nel meconio campioni con materna modelli di MAMP uso e stima di età gestazionale per indagare i fattori che potrebbero influenzare pOHMAMP disposizione. pOHMAMP è stato identificato più frequentemente e si è verificato a concentrazioni più elevate (mediana, 138 ng/g; intervallo, 3,5–345 ng/g) quando l’esposizione è continuata nel terzo trimestre (23 su 34 neonati, 67,6%) rispetto a quando l’uso di droghe è stato interrotto prima (11 su 50 neonati, 22,0%; mediana, 23,0 ng/g; intervallo, 1,2–343 ng/g). La frequenza di esposizione non era correlata alla presenza o alla concentrazione di pOHMAMP. L’età materna più giovane e la diminuzione del peso alla nascita sono stati associati alla presenza di pOHMAMP ma non sono stati linearmente correlati con le concentrazioni nel meconio; risultati simili sono stati osservati per MAMP e AMP(vedere Tabella 1 nel Supplemento di dati che accompagna la versione online di questa breve comunicazione a http://www.clinchem.org/content/vol56/issue5).

Il monitoraggio di pOHAMP e NOREPH non ha aumentato l’identificazione dei neonati affetti; questi analiti sono stati trovati solo in combinazione con MAMP e AMP. Sei neonati supplementari, tuttavia, tutti i quali hanno avuto risultati di screening negativi, sono stati identificati solo dalla presenza di pOHMAMP nel meconio. Ulteriori ricerche sono necessarie per determinare l’identità di altri biomarcatori reattivi al saggio immunologico e per ridurre la reattività crociata del saggio immunologico con altri analiti endogeni ed esogeni. Moore et al. ha identificato un’ampia percentuale di campioni di meconio risultati positivi nel saggio immunologico sulle anfetamine come positivi per pseudoefedrina o feniletilamina (13).

Quasi 1 neonato su 3 con uso materno di MAMP auto-segnalato, ma i risultati del meconio immuno-negativi hanno avuto risultati positivi di LC-MS/MS, sebbene la maggior parte delle concentrazioni fossero basse. La diminuzione della concentrazione di cutoff del saggio immunologico avrebbe potuto identificare più campioni veri positivi, ma dato il tasso di conferma già basso, probabilmente avrebbe anche identificato ulteriori campioni non confermati. Marin et al. confrontato direttamente il test EMIT (cutoff 200-ng/g) con un ELISA (cutoff 20-ng/g) (14). Nonostante il taglio ELISA inferiore, entrambi i saggi immunologici hanno dimostrato tassi equivalenti di falsi positivi rispetto ai risultati dei test di conferma cromatografica. Nei casi di abuso di MAMP da parte della madre, può essere consigliabile eseguire direttamente test cromatografici o includere neonati nel gruppo esposto alla MAMP sulla base di risultati positivi nei test del meconio o nell’auto-relazione materna, come è stato fatto nello studio IDEAL.

pOHMAMP era più spesso presente quando il consumo di anfetamine materne continuava nel terzo trimestre, ma la sua presenza non era influenzata dalla frequenza dell’uso di MAMP. Non è ancora chiaro quali altri fattori possano contribuire alla formazione e/o alla disposizione di pOHMAMP. MAMP è biotrasformato in AMP e pOHMAMP dal CYP2D6 (15), che ha >70 varianti alleliche (16) e una maggiore attività durante la gravidanza (17); la farmacogenomica dei partecipanti non è nota. Nelle urine predominano le concentrazioni immutate di MAMP, AMP e pOHMAMP (18, 19), simili alla disposizione nel meconio. Il fegato fetale produce CYP2D6 all’inizio della gestazione (20), ma la sua efficienza metabolica per MAMP è sconosciuta. Ulteriori studi sono necessari per chiarire quali fattori influenzano la disposizione dei biomarcatori nel meconio.

In sintesi, pOHMAMP da solo ha identificato ulteriori neonati esposti alle anfetamine, mentre pOHAMP e NOREPH no. I tassi di conferma del meconio immunoassay–positivo delle anfetamine non sono aumentati. Ulteriori ricerche sono necessarie per identificare specie cross-reattive che contribuiscono a risultati positivi non confermati nei test immunologici del meconio.