Articles

Soluominaisuudet ja ihmisen luteaalisolujen kahden rikastetun fraktion toiminta pitkittynyt viljely

Abstrakti

useimpien lajien keltarauhasessa on kaksi steroidogeenisten solujen alapopulaatiota. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli karakterisoida nämä solut ja tutkia niiden toimintaa pitkäjänteisen viljelyn aikana. Alku-ja myöhäisluteaalifaasien keltarauhaset hoidettiin mekaanisella ja entsymaattisella digestiolla, minkä jälkeen suoritettiin tiheyden sedimentaatio. Saatiin viisi erillistä solunauhaa, joista kaksi tuotti suuria määriä progesteronia. Näitä luonnehdittiin tiheyden, koon, steroidogeenisten entsyymien ja numeroiden mukaan. Yli 75% soluista ilmaistuna immunoreaktiivisena 3β-hydroksidehydrogenaasina (3β-HSD). Tiheämpää / pienempää kokoa olevia soluja saatiin luteaalivaiheen aikana yhä enemmän ja niitä oli enemmän kuin suuria soluja. Basal -, ihmisen koriongonadotropiini (HCG)-ja prostaglandiini E2-stimuloiduissa viljelyolosuhteissa progesteronisynteesi oli suurempi varhaisen, mutta ei myöhäisen luteaalivaiheen suurissa soluissa. Molemmat myöhäisestä, toisin kuin varhaisesta, luteaalisesta vaiheesta saadut solujakeet lisäsivät basaalisen progesteronintuotantoaan 9 päivän viljelyjakson aikana. Johtopäätöksemme on, että tämä menetelmä luteaalisolujen eristämiseksi ihmisessä tuottaa kaksi erillistä steroidogeenisten solujen alapopulaatiota, jotka reagoivat eri tavoin luteotrofisiin ärsykkeisiin. Voimme myös päätellä, että myöhäisen luteaalivaiheen solut lisäävät helposti progesteronisynteesiä 9 päivän aikana, mikä osoittaa siirtymistä pitkäikäisyyteen.

Johdanto

kuukautiskierron säännöllisyys sekä alkuraskauden säilyminen riippuvat keltarauhasen normaalista toiminnasta. Useimpien lajien CL koostuu kahdentyyppisistä steroidogeenisistä soluista, jotka erottuvat tiettyjen morfologisten ja toiminnallisten ominaisuuksien perusteella (Fitz et al., 1982; Rodgers ja O ’ Shea, 1982; Rodgers et al., 1983; Ohara ym., 1987; Nelson ym., 1992; Retamales ym., 1994). Ilmeisin morfologinen ero kahden luteaalisolutyypin välillä on niiden koko; siksi niitä kutsutaan yleensä suuriksi ja pieniksi luteaalisoluiksi. Kotieläimillä, kuten lehmillä ja lampailla, molemmat luteaalisolutyypit syntetisoivat merkittäviä määriä progesteronia viljeltäessä in vitro (Fitz et al., 1982; Rodgers ja O ’ Shea, 1982; Rodgers et al., 1983; Hoyer ym., 1984; Niswender ym., 1985; Lei et al., 1991). Progesteronin basaalituotanto on yleensä suurempi suurissa luteaalisoluissa verrattuna pieniin luteaalisoluihin (Rodgers et al., 1983) ja tämä näkyy heidän ultrarakenteessaan. Pienet solut kuitenkin yleensä osoittavat suhteellisesti suuremman kasvun progesteronin tuotannossa, kun ne altistuvat ihmisen koriongonadotropiinille (HCG), mikä viittaa erilaisiin mekanismeihin steroidogeneesin säätelyssä (Fitz et al., 1982; Rodgers ja O ’ Shea, 1982; Rodgers et al., 1983; Ohara ym., 1987; Retamales et al., 1994). Progesteronipitoisuuksien vähentäminen ääreisveressä on yksi luteolyysin ensimmäisistä indikaattoreista. Tämä alkuperäinen funktionaalinen luteolyyttinen vaihe näyttää olevan palautuva, koska luteotrooppiset aineet, ts. HCG ja prostaglandiini E2 (PGE2), Käänteinen varhaisen vaiheen luteolyysi ihmisen luteaalisoluissa in vitro (Dennefors et al., 1982; Fitz ym., 1984; Hahlin ym., 1988; Hagström ym., 1996). Sitä ei kuitenkaan täysin ymmärretä, riippuuko luteolyysi ensisijaisesti luteolyyttisten tekijöiden suorasta vaikutuksesta, luteotrofisten ärsykkeiden vähenemisestä tai näiden mekanismien yhdistelmästä.

useimmat kokeelliset tiedot luteaalisolujen kahden alapopulaation toiminnasta ja niiden erilaisista morfologisista ja toiminnallisista ominaisuuksista on saatu kotieläinten CL-soluilla tehdyistä kokeista (Fitz et al., 1982; Rodgers ym., 1983; Niswender ym., 1985). Harvat yritykset on tehty tutkia näitä ominaisuuksia ihmisen luteaalisoluissa (Ohara et al., 1987; Retamales et al., 1994; Carrasco et al., 1996) ja kaikki ovat koskeneet lyhytkestoisia kulttuureja. Luteolyysin aloittamisesta mahdollisesti vastuussa olevien solumuutosten tutkimiseksi tarvitaan pidempiaikaisia viljelmiä. Tämän tutkimuksen tavoitteet olivat kolminkertaiset: i) suunnitella kokeellinen malli ihmisen luteaalisia steroideja tuottavien solujen kahden alaluokan rikastettujen fraktioiden pitkäaikaiselle viljelmälle; ii) karakterisoida nämä solut tiheyden, koon ja steroidogeenisten ominaisuuksien osalta suhteessa luteaalifaasiin; ja iii) tutkia solujen steroidogeenista kapasiteettia pitkitetyn viljelyn aikana ajanjaksoina, jotka mahdollisesti ylittävät niiden ennalta määritetyn elinajan, ei-hedelmöitymissyklin aikana, jolla on luteotrofinen vaikutus ja jota ei ole.

materiaalit ja menetelmät

koehenkilöt

Keltarauhanen (n = 19) saatiin 25-45-vuotiailta naisilta, joille tehtiin vatsaleikkaus erilaisten hyvänlaatuisten muiden kuin munasarjojen tilojen, tyypillisesti myooman kohdun, vuoksi. Kaikki naiset antoivat tietoon perustuvan suostumuksen ennen tutkimusta, jonka Ruotsin Göteborgin yliopiston paikallinen eettinen komitea hyväksyi.

keltarauhasen iänmääritys

kolmen edellisen kuukautiskierron kaavasta, viimeisen kuukautiskierron ajankohdasta ja ovulaation oireista otettiin yksityiskohtaiset tiedot. Tutkimuksessa oli mukana vain naisia, joilla oli säännöllinen kuukautiskierto (kierron pituus 25-33 päivää). Naiset olivat olleet ilman hormonihoitoa vähintään 3 kuukautta ennen leikkausta. CL: n kokonaismorfologian arviointi in situ-aikana sekä välittömästi leikkauksen jälkeen tehtiin sen tutkimiseksi, täsmäsikö CL: n morfologinen ulkonäkö syklin ajankohtaan. Koottujen tietojen perusteella CL luokiteltiin joko varhaiseen luteaalivaiheeseen (0-4 päivää ovulaation jälkeen, n = 7) tai myöhäiseen luteaalivaiheeseen (>9 päivää ovulaation jälkeen, n = 9). Kolmea CL: ää, joita käytettiin ensimmäisissä solususpensiokokeissa, ei ajoitettu. CL: n määrä vaihtelee kussakin kokeellisessa ryhmässä riippuen solunsaannin vaihteluista kussakin valmisteessa.

Soluvalmiste

kaikki toimenpiteet suoritettiin steriileissä olosuhteissa. CL poistettiin kokonaan, jolloin munasarja poistui leikkauksen alussa ja laitettiin välittömästi jääkylmään Ca2+-ja Mg2+-vapaaseen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS; Life Technologies Inc, Paisley, Skotlanti, Iso-Britannia). 30 minuutin kuluessa kapseli ja suuret verisuonet poistettiin, minkä jälkeen keskiveritulppa irtosi. Jäljelle jäänyt kudos leikattiin sitten pieniksi paloiksi (märkäpaino ~1 mg), sijoitettiin 10 ml: aan PBS: ää täydennettynä kollagenaasi CLS 2: lla (2,5 mg / ml; Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NJ, USA) ja dnase type 2: lla (50 µg / ml; Boehringer-Mannheim, Mannheim, Saksa), ja inkuboidaan ravistelevassa vesihauteessa (37°C) 60 min. Sulaneet kudosnäytteet siivilöitiin 100 µm: n verkkosuodattimen (Falcon®; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) läpi, pelletoitiin 200 grammassa 5 minuutin ajan, pestiin kahdesti 10 ml: ssa PBS: ää ja sentrifugoitiin jälleen 200 g: ssa 5 minuutin ajan. Lopuksi solupelletti suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PBS: ää ja kerrostettiin percoll® (Pharmacia-Upjohn, Uppsala, Ruotsi) epäjatkuvaan gradienttiin 63, 54, 45, 27 ja 18%: n kerroksiin (tiheydet = 1, 088, 1, 076, 1, 064, 1, 041 ja 1.029 g/ml) ja sentrifugoitiin 20 minuutin ajan 400 g: ssa. solut otettiin talteen kaikista neljästä rajapinnasta, pestiin kolme kertaa soluviljelyalustalla (minimal essential medium with Earle ’ s salts; Life Technologies Inc, Paisley, Scotland, UK), jota täydennettiin 292 mg/ml l-glutamiinilla, 10% sikiön vasikan seerumilla ja 50 µg / ml gentamisiinilla. Jokaisesta vyöhykkeestä otetut näytteet laskettiin hemosytometrillä ja arvioitiin Trypan Blue exclusion-menetelmällä. Solujen elinkyky oli kaikissa kokeissa >90%.

solupopulaatioiden Luonnehdinta

ensimmäisissä kokeissa kaikkia viittä solukaistaa viljeltiin 48 tunnin ajan, minkä jälkeen analysoitiin progesteronipitoisuudet ehdollistetuissa elatusaineissa. Progesteronia tuottavat kaksi solukaistaa analysoitiin edelleen virtaussytometrialla. 1, 5×106 solua jokaisesta steroideja tuottavasta solunauhasta suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PBS: ää. Solut ajettiin välittömästi virtaussytometrin (Cytoron Absolute; Ortho, Raritan, NJ, USA) läpi ja laskettiin niiden solukoon perusteella eteenpäin scatterissa. Periaatteessa lasersäde hajaantuu joka kerta, kun se osuu soluun. Mitä suurempi kennon pinta-ala eli koko on, sitä suurempi osa lasersäteestä on hajallaan. Solujen kokoluokat tuottivat hajontapiikkejä mielivaltaisissa yksiköissä.

eräässä myöhäisen luteaalivaiheen CL: llä tehdyssä ylimääräisessä kokeessa analysoitiin myös progesteronia tuottavat kaksi soluketjua 3β-hydroksidehydrogenaasin (3β-HSD) ilmentymisen osalta immunohistokemian avulla. Sellejä viljeltiin kamarivyöryillä ja käsiteltiin 0.3% (w/v) H2O2:ta metanolissa 30 minuutin ajan (endogeenisen peroksidaasiaktiivisuuden minimoimiseksi), inkuboidaan yön yli (4°c) kanin polyklonaalisilla anti-3β-HSD-vasta-aineilla (1: 400) (anteliaasti tohtori I. Mason, Edinburgh, Skotlanti, UK) ja sen jälkeen kolme pesua PBS: ää. Testissä käytettiin herkkää tunnistussarjaa (Vecta Stain ABC kit), jossa oli toissijainen hevosen kaniinivasta-aine. Diat torjuttiin hematoksyliinillä ja asennettiin Pertexiin (Histolab, Göteborg, Ruotsi). Positiivinen värjäys visualisoitiin rusehtavana reaktiotuotteena.

kokeelliset menettelyt ja määritykset

Luteaalisolut (75×103 solua 0, 5 ml: ssa viljelyainetta kaivoa kohti) kylvettiin 24-kuopan kudoslevyihin ja viljeltiin 37°C: ssa ilmakehässä, jossa oli 5% CO2 ilmassa. Solujen annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan.kokeet aloitettiin ensimmäisellä viljelyaineen vaihdolla (0,5 ml). Seuraavan 48 tunnin aikana soluja viljeltiin joko eksogeenisen HCG: n kanssa tai ilman sitä (10-1000 IU/l; Profasi, Serono, Rooma, Italia) tai PGE2: n kanssa (1-100 µg/l; Sigma, St Louis, MO, USA). Pitkittyneen viljelyn aikana väliaineita, joissa on tai ei ole lisäaineita, vaihdettiin 48 tunnin välein. Viljelyainetta säilytettiin -20°C: ssa analysointiin asti. Progesteroni analysoitiin ajassa selvitetyllä fluoriimmunomäärityksellä (Delfia; Wallac Oy, Turku, Suomi), jonka inter – ja intra-määrityskertoimet olivat <9,6%. Kuoppien proteiinipitoisuus määritettiin Pierce BCA-Proteiinimäärityksellä (Pierce, Rockford, IL, USA).

tilastollinen analyysi

jokainen yksittäinen datapointti edustaa kahden tai kolmen kuopan keskiarvoa. Itseisarvot ilmaistaan keskiarvona ja vaihteluvälinä. Tilastollisen analyysin suorittamiseksi numerot on log muunnettu, jolloin saavutetaan materiaalin normalisoituminen ja hyväksyttävä vinous ja niurtoosi. Log-muunnetuilla luvuilla tilastollinen analyysi suoritettiin 1×2-varianssianalyysillä. P < 0, 05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi. Numerot annetaan välineinä ± sem.

tulokset

solupopulaatiot keltarauhasen varhais-ja myöhäisvaiheessa

Percollin gradientista tunnistettiin viisi erillistä solualuetta. Progesteronipitoisuudet väliaineessa ja valkuaisainepitoisuus 48 tunnin viljelyn jälkeen kussakin vyöhykkeessä on esitetty taulukossa I. lisätutkimuksia ja toiminnallisia kokeita on tehty niillä kahdella solukaistalla, joilla on ilmeinen kyky tuottaa progesteronia. Nämä solut haettiin kaistoista 18/27%: n ja 27/45%: n rajapinnoilla, koska solut olivat vastaavasti pienempiä (1.041–1.029 g/ml) ja tiheämpiä (1.064–1.041 g/ml). Immunohistokemiallinen värjäys 3β-HSD: n vasta-aineilla osoitti, että >75% kunkin fraktion soluista oli positiivisia. Virtaussytometrialla pienemmän tiheyden solujen koko (piikki eteenpäin hajaantuessa noin 96 mielivaltaista yksikköä) määritettiin suuremmaksi kuin suuremman tiheyden solujen koko (piikki noin 84 mielivaltaista yksikköä). Näistä soluista käytetään jäljempänä nimitystä suuret CL-solut (lclc) ja pienet CL-solut (SCLC). Myöhäisen luteaalivaiheen valmistamisen jälkeen saatiin merkitsevästi (P = 0, 035) enemmän SCLC: tä kuin LCLC: tä, kun taas varhaisvaiheen luteaalivaiheessa ei havaittu merkittävää eroa. SCLC: tä oli yleensä enemmän kuin LCLC: tä. Haetun SCLC: n määrä kasvoi varhaisesta (SCLC/early: 5.6×106 solua, vaihteluväli 2.2–9.9) myöhäiseen (SCLC/late: 7.6×106 solua, vaihteluväli 4.4–10.3) luteaalivaiheesta, kun taas LCLC: n määrä väheni (LCLC/early: 4.2×106 solua, vaihteluväli 1.1–11.3; LCLC/late: 1.8×106 solua, vaihteluväli 1.2–2.8) luteaalivaiheen kulku.

progesteronituotanto rikastetuissa luteaalisoluissa lyhytaikaisessa viljelmässä

48 tunnin viljelyn aikana molemmat luteaalisolutyypit reagoivat HCG: hen siten, että progesteronin synteesi lisääntyi annosriippuvaisesti (Kuva 1). Varhaisluteaalivaiheen CL: ssä progesteronintuotanto oli suurempi, kun keskimääräinen basaalinen progesteroninmuodostus 48 h: n viljelyjakson aikana oli 92, 1 nmol/l l: lle ja 37, 2 nmol/l SCLC: lle. Myöhäisen luteaalivaiheen CL: ssä keskimääräinen basaalisen progesteronin muodostuminen oli 6, 7 nmol/l LCLC: llä ja 18, 3 nmol/l SCLC: llä. Lclc varhaisesta luteaalivaiheesta syntetisoi korkeammat progesteronipitoisuudet kuin SCLC. Solutyyppien välillä ei havaittu eroa myöhäisen luteaalivaiheen aikana. Progesteronisynteesi HCG: n stimuloimista soluista oli merkitsevästi suurempi (p < 0.0001 kaikissa ryhmissä) pitoisuuksilla 100 IU/l ja 1000 IU/l vertailuryhmään verrattuna, mutta HCG: n suhteellinen stimuloiva vaikutus oli voimakkaampi soluissa, jotka saatiin myöhäisestä luteaalivaiheesta kuin varhaisesta luteaalivaiheesta (Kuva 1) ja saavutti saturaation korkeimmalla pitoisuudella. Merkitsevä ero vertailuryhmän ja 10 IU/l HCG-stimulaation välillä oli merkitsevä vain myöhäisen luteaalivaiheen soluissa (P = 0, 11 varhaisvaiheen soluissa ja P = 0, 0326 myöhäisvaiheen soluissa). Kuvassa 2 esitetään progesteronisynteesin annosriippuvainen vaste PGE2: lle. Solujakeiden välillä ei havaittu merkittävää eroa. Toisin kuin vaiheesta riippuva vaste HCG: lle, PGE2: n vasteessa ei havaittu eroa varhaisen tai myöhäisen luteaalivaiheen soluissa.

pitkittynyt soluviljely

basaalinen progesteronisynteesi eri-ikäisten ja-kokoisten luteaalisolujen pitkitetyn viljelyn aikana on kuvattu kuvassa 3. Varhaisen luteaalivaiheen CL-solut osoittivat koosta riippumatta progesteronituotannon jatkuvan vähenemisen pitkittyneen viljelyn aikana. Sen sijaan myöhäisen luteaalivaiheen solut osoittivat progesteronisynteesin jatkuvan lisääntymisen, ja tämä oli erityisen voimakasta SCLC: ssä. Varhaisen ja myöhäisen luteaalivaiheen solujen välinen ero oli merkittävä (P = 0, 046).

erillisissä kokeissa proteiinipitoisuus mitattiin 1, 3, 5, 7, 9 päivän viljelyn aikana. Proteiinipitoisuus kasvoi molempien solutyyppien varhais – ja myöhäisluteaalivaiheen viljelmissä (Kuva 4), mutta nousu oli huomattavasti suurempi myöhäisluteaalivaiheesta saaduissa soluissa (P = 0, 017).

Keskustelu

pienten ja suurten luteaalisolujen kokojakaumaa koskevat yksityiskohtaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että joillakin kädellislajeilla, kuten reesusapinalla, erilliset solupopulaatiot voidaan rajata koon mukaan (Brannin and Stouffer, 1991b). Muilla kädellislajeilla, esimerkiksi marmosettiapinalla, on jatkuva kokojakauma (Brannian and Stouffer, 1991a). Tässä tutkimuksessa kaksi erillistä bändejä steroideja tuottavia soluja eristettiin ihmisen CL sekä varhaisen ja myöhäisen luteaalivaiheen. Koska nämä solut erosivat toisistaan sekä tiheydeltään että solukooltaan, nämä kaksi vyöhykettä edustavat todennäköisimmin suurten ja pienten luteaalisolujen rikastettuja fraktioita. Samankokoisia ja tiheyssuhteita ihmisen luteaalisolujen on raportoitu esiintyvän cl-kudoksessa keskimmäisestä luteaalivaiheesta (Retamales et al., 1994).

pienten ja suurten luteaalisolujen suhteellisten osuuksien muutoksen koko CL: n elinkaaren aikana on esitetty esiintyvän naudan ja ihmisen CL: ssä (Lei et al., 1991). Ei ole selvää, johtuuko muutos pienten solujen hypertrofiasta vai pienten solujen erilaistumisesta suuriksi soluiksi. Lampailla kokeelliset tiedot ovat osoittaneet, että luteinisoiva hormoni (LH) / HCG stimulaatio johtaa pienten luteaalisolujen muuntumiseen suuriksi (Farin et al., 1988). Kun ihmisen CL:n tutkimuksessa käytettiin kuvaanalyysijärjestelmää, havaittiin, että pienten ja suurten luteaalisolujen suhde kudososioissa väheni asteittain 9:1: stä varhaisvaiheessa 3: 1: een myöhäisvaiheen CL: ssä (Lei et al., 1991). Sen sijaan matalampi ja lähes vakaa suhde havaittiin satunnaisesti valittujen solujen visuaalisen laskennan menetelmällä (Retamales et al., 1994). Tässä tutkimuksessa SCLC: n suhteellinen saanto kasvoi CL: n iän myötä. SCLC/LCLC-solujen suhde solujakeissamme kasvoi varhaisen luteaalivaiheen 1,3: sta CL: stä 4,2: een myöhään ja tämä johtui lähinnä lclc: n määrän vähenemisestä myöhäisen luteaalivaiheen aikana. Lclc: n määrän väheneminen on yhdenmukainen reesusapinan CL: n havaintojen kanssa (Brannian and Stouffer, 1991a), mutta eroaa yhdestä ihmisen CL: n kudoksen tutkimuksesta (Lei et al., 1991). Voimme vain spekuloida, miksi ihmisen luteaalisolujen suhdevaihteluissa on eroja. Tässä tutkimuksessa on käytetty soluja erottamisen jälkeen entsymaattisella digestiolla ja solutiheyden sedimentaatiolla, eikä varsinaisesti laskettu solujakaumaa kudoksessa. On mahdollista, että tiettyjen solutyyppien uuttaminen vaihtelee luteaalivaiheen aikana johtuen kudosorganisaation, vaskularisaation ja kuitupitoisuuden eroista nuorissa ja vanhoissa CL: ssä, mikä johtaisi yhden tietyn solutyypin säilymiseen missä tahansa vaiheessa. On myös tärkeää pitää mielessä, että tutkimuksessa, jossa solut lasketaan kudoslohkoihin (Retamales et al., 1994) solujen jakautuminen voi vaihdella analysoitavan CL: n erityisalueen mukaan. Ihmisen CL: ssä suhteellisesti enemmän pieniä luteaalisoluja sijaitsee keltarauhasen reuna–alueella, joka koostuu pääasiassa infoldoituneesta Teka-luteiinialueesta. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet steroideja tuottavien solujen rikastettuja fraktioita, joissa on >75% steroidogeenisia soluja, jotka on saatu koko CL: stä. On kohtuullista olettaa, että solujen SCLC-fraktiolla on suurempi endoteelisolujen sekä immuunisolujen kontaminaatio, koska niiden tiheydet ovat samanlaiset. Tämä jälkimmäinen seikka voi osittain selittää solujen määrän kasvun jakeissa myöhäisestä CL: stä, kun raportoitu samanaikainen virta immuunisoluja (Brännström et al., 1994; Brännström and Fridén, 1997; Duncan et al., 1998). Tuoreessa tutkimuksessa ihmisen steroidogeenisia luteaalisoluja kontaminoivien valkosolujen määrä vastaavilla toimenpiteillä saatiin 20% (Castro et al., 1998). Valkosolujen ja/tai endoteelisolujen vaihteleva osuus voi selittää SCLC: n progesteronisynteesissä havaitun vaihtelun, koska molemmat solutyypit erittävät tekijöitä, jotka vaikuttavat steroidogeneesiin ihmisen CL: ssä in vitro (Emi et al., 1991; Apa et al., 1998; Castro et al., 1998; Hashii et al., 1998).

lyhytkestoisissa viljelmissä 48 tunnin kuluttua havaitsimme kolme kertaa suuremman proteiinipitoisuuden SCLC: hen verrattuna LCLC: hen (taulukko I). On mahdollista, että elinkelpoisiin soluihin kiinnittyneet proteiinijätteet rikastuvat suuremmassa määrin tässä tiheässä fraktiossa. Pitkittyneessä viljelmässä solujen proteiinipitoisuus kasvoi jatkuvasti 9 päivän aikana. Tämä lisääntyminen voi johtua kontaminoivien fibroblastien ja/tai endoteelisolujen proliferaatiosta, mutta se voi myös osittain merkitä solunsisäisen kokonaisproteiinin lisääntymistä viljelmäolosuhteissa. Tätä on raportoitu aikaisemmin rotan suurissa luteaalisoluissa in vivo-luteaalikehityksen aikana (McLean ym., 1992). DNA: n tai tymidiinin inkorporaation arvioinnista olisi tässä yhteydessä hyötyä solujen kehittymisen ja proliferaation erottelussa.

meidän olosuhteissamme LCLC osoitti suurempaa basaalisen progesteronin eritystä kuin SCLC. Progesteronin synteesi oli noin kolme kertaa suurempi LCLC: ssä, mikä on verrattavissa aiempiin havaintoihin noin viisinkertaisista pitoisuuksista lampaan suurissa luteaalisoluissa (Rodgers and O ’ Shea, 1982; Rodgers et al., 1983) ja aiempien tutkimusten mukaisesti suuria ja pieniä luteaalisoluja ihmisen munasarjasta (Ohara et al., 1987; Retamales ym., 1994). Solumekanismit, jotka ovat vastuussa tästä erosta steroidogeenisessa kapasiteetissa in vivo ja in-vitro-olosuhteissa, joihin on lisätty seerumia, voivat olla suurempi kolesterolin sivuketjun pilkkoutumisentsyymin, sterolikantajaproteiini-2: n pitoisuus (McLean et al., 1992), expression of StAR (Chung et al., 1998), tai suurempi sitoutuminen low-density lipoproteins (LDL) (Brannin et al., 1995). Toisin kuin suuret solut, sekä lampaan että ihmisen pienet luteaaliset solut erittävät vähäisiä basaalimääriä progesteronia, mutta niillä on kyky vastata LH / HCG-stimulaatioon lisääntyneellä progesteronituotannolla (Fitz et al., 1982; Ohara ym., 1987; Retamales et al., 1994). On toki mahdollista, että proteolyyttinen ruoansulatus jopa kollagenaasin avulla voi heikentää hormonireseptorien eli LH-reseptorin toimintaa solun pinnalla. On vaikea spekuloida entsyymien erivaikutusta samaan hormonireseptoriin eri luteaalisolutyypeissä. Erot reagointikyvyssä selittyvät todennäköisemmin reseptorimäärien eroilla. Tällainen ero on havaittu useilla lajeilla (Gebarowska et al., 1997; Takao et al., 1997; Mamluk et al., 1998). Kokeellisessa mallissamme molemmat solutyypit osoittivat kuitenkin annosriippuvaista progesteronin erityksen lisääntymistä vastauksena HCG: lle, oletettavasti LH-reseptorin kautta. Mielenkiintoista on, että myöhäisen luteaalivaiheen LCLC osoitti suuremman vasteen HCG: lle verrattuna varhaisen luteaalivaiheen solujakeisiin. Tämä havainto on makakiapinasta saatujen tulosten mukainen (Brannin and Stouffer, 1991b). SCLC: ssä tätä eroa HCG: n vasteessa ei ollut luteaalisen iän suhteen. PGE2: n stimuloiva vaikutus ei eronnut solun koon tai luteaalivaiheen mukaan. Voidaan olettaa, että elinkaaren aikana cl tiettyjen steroideja tuottavien solujen valmistautuvat cl pelastus osoituksena niiden lisääntynyt alttius vastata HCG eikä PGE2.

tutkimuksen yhtenä tavoitteena oli valottaa CL: n pelastus-ja regressioprosessia. Puhdistettujen luteaalisolujen pitkäaikainen viljely osoittaisi, ovatko pelastus-ja regressio riippuvaisia solujen ulkoisista tai sisäisistä tekijöistä. Tämän tutkimuksen merkittävä havainto on, että myöhäisen luteaalivaiheen luteaalisolut lisäävät tyvi-progesteronimuodostustaan viljelyn aikana huomattavasti enemmän kuin niiden oletettu regressioaika hedelmöitymättömässä syklissä in vivo. Sen sijaan luteaalisoluissa varhaisvaiheesta progesteronin muodostuminen väheni ajan myötä viljelmässä. Tämä ero kykyyn ylläpitää steroidogeenisen toiminnan voi osoittaa, että siirtymisen aikana varhaisesta myöhäiseen vaiheeseen luteal, solut saavat valmiudet pelastaa HCG tapauksessa raskauden. Mahdollisesti LH helpottaa tätä siirtymistä pitkäikäisyyteen vaikuttamalla keskihytyluteaalivaiheen aikana. Tämä voisi selittää, miksi luteaalivaihe gonadotropiinia vapauttavassa hormonissa (GnRH), jossa LH-pitoisuudet ovat alhaiset, on lyhyempi kuin klomifeenisitraatti-ihmisen menopausaalisissa gonadotropiinisykleissä (HMG) tai luonnollisissa sykleissä (Smitz et al., 1988). Myös muissa ihmisen CL: n trofiatekijöissä, kuten integriinissä ja fibronektiinissa, esiintyy vaiheista riippuvia muutoksia (Honda et al., 1997) ja voi olla selittävä malli tälle CL-solujen luontaiselle muutokselle, joka tekee niistä pitkäikäisiä. Tietomme ovat siis yhteensopivia sen näkemyksen kanssa, että ihmisen luteolyysi on aktiivinen prosessi, johon liittyy solu-ja/tai biokemiallisia elementtejä.

taulukko I.

progesteronin synteesi ihmisen keltarauhassolujen eri kaistoilla epäjatkuvan Perkolligradientin fraktioinnin jälkeen. Kunkin ryhmän solut kylvettiin kaivoihin ja viljeltiin 48 tunnin ajan 24 tunnin esikasvatusjakson jälkeen. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja kolmesta CL: stä

Sellinauha . progesteroni (pmol/µg proteiinia) . progesteroni (pmol/well) . proteiini (µg / hyvin).
Yläjäämä 0.3 1.5 5.0
18/27% Percoll-liitäntä 12.4 67.0 5.4
27/45% Percollin liittymä 3.1 48.7 15.7
45/54% Percoll-liitäntä 0 0 6.2
54/63% Percoll-liitäntä 0 0 8.9
Sellinauha . progesteroni (pmol/µg proteiinia) . progesteroni (pmol/well) . proteiini (µg / hyvin).
Yläjäämä 0.3 1.5 5.0
18/27% Percollin liittymä 12.4 67.0 5.4
27/45% Percoll-liitäntä 3.1 48.7 15.7
45/54% Percoll-liitäntä 0 0 6.2
54/63% Percoll-liitäntä 0 0 8.9
taulukko I.

progesteronin synteesi ihmisen keltarauhassolujen eri kaistoilla epäjatkuvan Perkolligradientin fraktioinnin jälkeen. Kunkin ryhmän solut kylvettiin kaivoihin ja viljeltiin 48 tunnin ajan 24 tunnin esikasvatusjakson jälkeen. Esitetyt arvot ovat keskiarvoja kolmesta CL: stä

Sellinauha . progesteroni (pmol/µg proteiinia) . progesteroni (pmol/well) . proteiini (µg / hyvin).
Yläjäämä 0.3 1.5 5.0
18/27% Percoll-liitäntä 12.4 67.0 5.4
27/45% Percollin liittymä 3.1 48.7 15.7
45/54% Percoll-liitäntä 0 0 6.2
54/63% Percoll-liitäntä 0 0 8.9
Sellinauha . progesteroni (pmol/µg proteiinia) . progesteroni (pmol/well) . proteiini (µg / hyvin).
Yläjäämä 0.3 1.5 5.0
18/27% Percollin liittymä 12.4 67.0 5.4
27/45% Percoll-liitäntä 3.1 48.7 15.7
45/54% Percoll-liitäntä 0 0 6.2
54/63% Percoll-liitäntä 0 0 8.9

Kuvat 1.

suurten keltarauhasen (LCLC) ja pienten keltarauhasen (SCLC) solujen Ehdollistetuissa väliaineissa olevat progesteronipitoisuudet, jotka on saatu varhaisesta (n = 7) ja myöhäisestä (N = 4) keltarauhasen vaiheesta. Soluja viljeltiin 48 tunnin ajan eri pitoisuuksilla koriongonadotropiinia (HCG) (10, 100, 1000 IU/l). Progesteronin (P) pitoisuudet (nmol/l) muunnettiin log-muotoon. P-arvot viittaavat kontrollisolujen (LCLC + SCLC) ja käsiteltyjen solujen (LCLC + SCLC) välisiin eroihin. P < 0, 0001 (pienet vai suuret solut) varhaisen luteaalivaiheen osalta ja P = 0.1128 (pienet ja suuret solut) myöhäisessä luteaalivaiheessa.

Kuva 1.

suurten keltarauhasen (LCLC) ja pienten keltarauhasen (SCLC) solujen Ehdollistetuissa väliaineissa olevat progesteronipitoisuudet, jotka on saatu varhaisesta (n = 7) ja myöhäisestä (N = 4) keltarauhasen vaiheesta. Soluja viljeltiin 48 tunnin ajan eri pitoisuuksilla koriongonadotropiinia (HCG) (10, 100, 1000 IU/l). Progesteronin (P) pitoisuudet (nmol/l) muunnettiin log-muotoon. P-arvot viittaavat kontrollisolujen (LCLC + SCLC) ja käsiteltyjen solujen (LCLC + SCLC) välisiin eroihin. P < 0, 0001 (pienet vai suuret solut) varhaisluteaalivaiheessa ja P = 0, 1128 (pienet vai suuret solut) myöhäisluteaalivaiheessa.

kuva 2.

suurten keltarauhasen (LCLC) ja pienten keltarauhasen (SCLC) varhaisesta (n = 7) ja myöhäisestä (N = 4) keltarauhasen vaiheesta saadut progesteronipitoisuudet (P) ehdollistetuissa väliaineissa. Soluja viljeltiin 48 tunnin ajan erilaisilla prostaglandiini E2: n (PGE2) pitoisuuksilla (1, 10, 100 µg/l). Progesteronipitoisuudet (nmol/l) muunnettiin log-muotoon. P-arvot viittaavat kontrollisolujen (LCLC + SCLC) ja käsiteltyjen solujen (LCLC + SCLC) välisiin eroihin. P = 0, 0005 (pienet vai suuret solut) varhaisluteaalivaiheessa ja P = 0, 0451 (pienet vai suuret solut) myöhäisluteaalivaiheessa.

kuva 2.

suurten keltarauhasen (LCLC) ja pienten keltarauhasen (SCLC) varhaisesta (n = 7) ja myöhäisestä (N = 4) keltarauhasen vaiheesta saadut progesteronipitoisuudet (P) ehdollistetuissa väliaineissa. Soluja viljeltiin 48 tunnin ajan erilaisilla prostaglandiini E2: n (PGE2) pitoisuuksilla (1, 10, 100 µg/l). Progesteronipitoisuudet (nmol/l) muunnettiin log-muotoon. P-arvot viittaavat kontrollisolujen (LCLC + SCLC) ja käsiteltyjen solujen (LCLC + SCLC) välisiin eroihin. P = 0, 0005 (pienet vai suuret solut) varhaisluteaalivaiheessa ja P = 0, 0451 (pienet vai suuret solut) myöhäisluteaalivaiheessa.

kuva 3.

basal progesteronin (P) synteesi pitkitetyn viljelyn aikana suurten keltarauhassolujen (LCLC) ja pienten keltarauhassolujen (SCLC) varhaisvaiheen (N = 5) ja myöhäisen (n = 8) luteaalivaiheen aikana. Solut inokuloitiin kuhunkin kaivoon ja viljeltiin 9 päivän ajan 24 tunnin preinkubaatiojakson jälkeen. Päivä 1 asetetaan 100%: iin kullekin solutyypille. Avoimet palkit edustavat LCLC: tä, täytetyt palkit edustavat SCLC: tä. Arvot ilmoitetaan keskiarvoina ± sem

kuva 3.

basal progesteronin (P) synteesi pitkitetyn viljelyn aikana suurten keltarauhassolujen (LCLC) ja pienten keltarauhassolujen (SCLC) varhaisvaiheen (N = 5) ja myöhäisen (n = 8) luteaalivaiheen aikana. Solut inokuloitiin kuhunkin kaivoon ja viljeltiin 9 päivän ajan 24 tunnin preinkubaatiojakson jälkeen. Päivä 1 asetetaan 100%: iin kullekin solutyypille. Avoimet palkit edustavat LCLC: tä, täytetyt palkit edustavat SCLC: tä. Arvot ilmoitetaan keskiarvoina ± sem

Kuva 4.

kumulatiivinen kokonaisproteiinipitoisuus kaivoa kohti suurten keltarauhassolujen (LCLC) ja pienten keltarauhassolujen (SCLC) varhaisen ja myöhäisen luteaalivaiheen pitkäaikaisen viljelyn aikana. Solut inokuloitiin kuhunkin kaivoon ja viljeltiin 9 päivän ajan 24 tunnin preinkubaatiojakson jälkeen. Päivä 1 asetetaan 100%: iin kullekin solutyypille. Täytetyt symbolit edustavat soluja myöhäisestä luteaalisesta vaiheesta ja avoimet symbolit soluja varhaisesta luteaalisesta vaiheesta.

Kuva 4.

kumulatiivinen kokonaisproteiinipitoisuus kaivoa kohti suurten keltarauhassolujen (LCLC) ja pienten keltarauhassolujen (SCLC) varhaisen ja myöhäisen luteaalivaiheen pitkäaikaisen viljelyn aikana. Solut inokuloitiin kuhunkin kaivoon ja viljeltiin 9 päivän ajan 24 tunnin preinkubaatiojakson jälkeen. Päivä 1 asetetaan 100%: iin kullekin solutyypille. Täytetyt symbolit edustavat soluja myöhäisestä luteaalisesta vaiheesta ja avoimet symbolit soluja varhaisesta luteaalisesta vaiheesta.

4

kenelle kirjeenvaihto on osoitettava: Department of Reproductive Medicine, University of California, San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA 92093-0633, USA

Kiitämme professori Gregory Ericksonia San Diegon yliopistosta erinomaisista tieteellisistä neuvoista tämän käsikirjoituksen laatimiseksi. Tutkimusta tukivat Ruotsin lääketieteellisen tutkimuksen neuvosto (Apurahat nro 11237 M. H.: lle ja 11607 M. B.: lle), Göteborgin yliopiston lääketieteellinen tiedekunta, Göteborgin Lääkäriseura ja kauppias Hjalmar Svenssonin säätiö.

Apa, R., Miceli, F., Feo, D. et al. (

1998

) endoteliini-1 estää basal-ja ihmisen koriongonadotropiinin stimuloimaa progesteronin tuotantoa.

Hum. Reprod.

,

13

,

2425

–2429.

brannian, J. D., Larson, E. A., Kurz, S. G. ym. (

1995

) vetyperoksidi estää sian luteaalisolujen alhaisen tiheyden lipoproteiinin (LDL) sisäänoton ja LDL: n tukeman steroidogeneesin.

Mol. Solu. Endokrinolia.

,

111

,

213

–218.

Brannian, J. D. ja Stouffer, R. L. (

1991

) Cellular approaches to understanding the function and regulation of the primate corpus luteum.

Sem. Reprod. Endokrinolia.

,

9

,

41

–351.

Brannian, J. D. ja Stouffer, R. L. (

1991

) progesteronin tuotanto apinoiden luteaalisolujen alapopulaatioissa kuukautiskierron eri vaiheissa: agonistien reagointikyvyn muutokset.

Biol. Reprod.

,

44

,

141

–149.

Brännström, M. ja Fridén, B. E. (

1997

) keltarauhasen immuunisäätely.

Sem. Reprod. Endokrinolia.

,

15

,

363

–370.

Brännström, M., Pascoe, V., Norman, R. J. ym. (

1994

) leukosyyttien lokalisointi follikkelin seinämässä ja keltarauhasessa koko ihmisen kuukautiskierron ajan.

hedelmällinen. Steril.

,

61

,

488

–495.

Carrasco, I., Troncoso, J. L., Devoto, L. et al. (

1996

) ihmisen luteaalisolujen alapopulaatioiden differentiaalinen steroidogeeninen vaste.

Hum. Reprod.

,

11

,

1609

–1614.

Castro, A., Castro, O., Troncoso, J. L. ym. (

1998

) luteaaliset leukosyytit ovat ihmisen keskiluteaalisolujen steroidogeenisen prosessin modulaattoreita.

Hum. Reprod.

,

13

,

1584

–1589.

Chung, P. H., Sandhoff, T. W. ja McLean, M. P. (

1998

) hormoni ja prostaglandiini F2 alfa-säätely lähetti ribonukleiinihapon koodaamalla steroidogeenista akuuttia säätelyproteiinia ihmisen keltarauhasessa.

Umpieritys

,

8

,

153

-160.

Duncan, W. C., Rodger, F. E. ja Illingworth, P. J. (

1998

) ihmisen keltarauhanen: makrofagien määrän väheneminen simuloidussa äidin tunnistamisessa raskaudeksi.

Hum. Reprod.

,

13

,

2435

–2442.

Emi, N., Kanzak, H., Yoshida, M. et al. (

1991

) lymfosyytit stimuloivat progesteronin tuotantoa viljellyillä ihmisen granulosaluteaalisoluilla.

Am. J. Obstet. Gynekomastia.

,

165

,

1469

–1474.

Farin, C. E., Moeller, C. L., Mayan, H. et al. (

1988

) luteinisoivan hormonin ja ihmisen koriongonadotropiinin vaikutus lampaan keltarauhasen solupopulaatioihin.

Biol. Reprod.

,

38

,

413

–421.

Fitz, T. A., Mayan, M. H., Sawyer, H. R. ym. (

1982

) lampaan keltarauhasen kahden steroidogeenisen solutyypin Luonnehdinta.

Biol. Reprod.

,

27

,

703

–711.

Fitz, T. A., Mock, E. J., Mayan, M. H. ym. (

1984

) prostaglandiinien yhteisvaikutukset lampaan luteaalisolujen alapopulaatioiden kanssa. II.Pgf2a: n Inhibitoriset vaikutukset ja PGE2: n antama suoja.

prostaglandiinit

,

28

,

127

.

Gebarowska, D., Ziecik, A. J. ja Gregoraszcuk, E. L. (

1997

) preovulatorisista follikkeleista ja luteaalisoluista peräisin olevien granulosasolujen luteinisoivan hormonin reseptoreihin sikojen kiimasyklin aikana.

Anim. Reprod. Sci.

,

49

,

191

–205.

Hagström, H.-G., Hahlin, M., Bennegård-Edén, B. et al. (

1996

) keltarauhasen toiminnan säätely ihmisen raskauden alkuvaiheessa.

Fertil. Steril.

,

65

,

81

–86.

Hahlin, M., Dennefors, B., Johanson, C. et al. (

1988

) prostaglandiini E2: n Luteotrooppiset vaikutukset kuukautiskierron ja alkuraskauden ihmisen keltarauhaseen.

J. Clin. Endokrinolia. Metab.

,

66

,

909

–914.

Hashii, K., Fujiwara, H., Yoshioka, S. et al. (

1998

) perifeerisen veren mononukleaarisolut stimuloivat progesteronin tuotantoa raskaana olevien ja ei-raskaana olevien naisten luteaalisolujen avulla: interleukiini-4: n ja interleukiini-10: n mahdollinen osallistuminen keltarauhasen toimintaan ja erilaistumiseen.

Hum. Reprod.

,

13

,

2738

–2744.

Honda, T., Fujiwara, H., Yamada, S. ym. (

1997

) Integriini α5 ilmentyy ihmisen luteinisoivissa granulosasoluissa keltarauhasen muodostumisen aikana, ja sen ilmentymistä tehostaa ihmisen koriongonadotropiini

in vitro. Mol. Hum. Reprod.

,

3

,

979

–984.

Hoyer, P. B., Fitz, T. A. ja Niswender, G. D. (

1984

) adenylaattisyklaasin hormoneista riippumaton aktivaatio suurissa steroidogeenisissä lampaan luteaalisoluissa ei lisää progesteronin eritystä.

Endokrinologia

,

114

,

604

.

Lei, Z. M., Chegini, N. ja Rao, C. V. (

1991

) ihmisen ja naudan keltarauhasen kvantitatiivinen solukoostumus eri lisääntymistiloista.

Biol. Reprod.

,

44

,

1148

–1156.

Mamluk, R., Chen, D., Greber, Y. ym. (

1998

) messenger ribonukleiinihapon ilmentymisen luonnehtiminen prostaglandiini F2 alfa-ja luteinisoivan hormonin reseptoreille eri naudan luteaalisolutyypeissä.

Biol. Reprod.

,

58

,

849

–856.

McLean, M. P., Nelson, S. E., Billheimer, J. T. ym. (

1992

) Differentiaalikapasiteetti kolesterolin kuljetukseen ja käsittelyyn suurissa ja pienissä rotan luteaalisoluissa.

Endokrinologia

,

131

,

2203

-2212.

Nelson, S. E., McLean, M. P., Jayatilah, P. G. et al. (

1992

) tiineen rotan keltarauhasen muodostavien solusalapopulaatioiden eristäminen, luonnehtiminen ja viljely.

Endokrinologia

,

130

,

954

-966.

Niswender, G. D., Schwall, R. H., Fitz, T. A. ym. (

1985

) luteaalitoiminnan säätely kotieläiminä pidetyissä märehtijöissä. Uusia käsitteitä.

Rec. Prog. Horm. Res.

,

41

,

101

-105.

O’Hara, A., Mori, T., Taii, S. et al. (

1987

) kuukautiskierron kypsästä ihmisen keltarauhasesta eristettyjen kahdentyyppisten luteaalisolujen steroidogeneesissä tapahtuva toiminnallinen erilaistuminen.

J. Clin. Endokrinolia. Metab.

,

65

,

1192

–1200.

Retamales, I., Carrasco, L., Troncoso, J. L. ym. (

1994

) Morpho-functional study of human luteal cell subpopulations.

Hum. Reprod.

,

9

,

591

–596.

Rodgers, R. J. ja O ’ Shea, J. D. (

1982

) lampaiden keltarauhasesta eristettyjen kolmen solutyypin Puhdistus, morfologia ja progesteronin tuotanto ja sisältö.

Aust. J. Biol. Sci.

,

35

,

441

–455.

Rodgers, R. J., O ’ Shea, J. D. ja Findlay, J. K. (

1983

) progesteronin tuotanto in vitro pienissä ja suurissa lampaan luteaalisoluissa.

J. Reprod. Fertil.

,

69

,

113

–124.

Smitz, J., Devroey, P., Camus, M. ym. (

1988

) luteaalivaihe ja alkuraskaus yhdistelmähoidon GnRH-agonisti/HMG superovulaatiohoidon jälkeen IVF-tai GIFT-hoidossa.

Hum. Reprod.

,

3

,

585

–590.

Takao, Y., Honda, T., Ueda, M. et al. (

1997

) Immunohistochemical localization of the LH/HCG receptor in human ovary: HCG enhances cell surface expression of LH/HCG receptor on luteinzing granulosa cells in vitro.

Mol. Hum. Reprod.

,

3

,

569

–578.