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Neue Mekonium-Biomarker für die pränatale Methamphetamin-Exposition erhöhen die Identifizierung betroffener Neugeborener | Web Root

Säuglinge, die pränatal Methamphetamin (MAMP) 10 ausgesetzt sind, sind für ihr Gestationsalter eher klein, haben ein niedrigeres Geburtsgewicht (1) und erfahren einen erhöhten physiologischen Stress (2). Die Identifizierung von MAMP-exponierten Säuglingen ist unerlässlich, nicht nur um medizinische, verhaltensbezogene und soziale Interventionen zu etablieren, sondern auch um Langzeiteffekte zu charakterisieren. In der Säuglingsentwicklung, Umwelt und Lebensstil (IDEAL) Studie, 71.0% der betroffenen Neugeborenen wurden nur durch mütterliche Offenlegung während des Interviews nach der Geburt und nicht durch positive Ergebnisse in Mekoniumtests identifiziert; 25,2% wurden durch Selbstbericht und positive Mekoniumergebnisse identifiziert, und 3,8% wurden nur durch Mekoniumanalyse identifiziert (3).

Wir schlugen mögliche Erklärungen für die niedrige Nachweisrate in Mekonium vor. Erstens stoppten die meisten Frauen in der IDEAL-Studie die Anwendung von MAMP im ersten oder zweiten Trimester (3, 4). Mekonium beginnt sich im zweiten Trimester zu bilden, und Daten aus unserem Labor und anderen deuten darauf hin, dass die Arzneimittelexposition im zweiten Trimester im Mekonium schlecht reflektiert wird (5, 6). Tatsächlich testeten Mekoniumproben eher positiv, wenn der MAMP-Drogenkonsum der Mutter bis ins dritte Trimester anhielt und einmal pro Woche überschritten wurde (3); Dennoch hatten 54,3% der Neugeborenen, die während des dritten Trimesters exponiert waren, Amphetamin-negatives Mekonium.

Zweitens kann das Testverfahren zu einer geringen Anzahl Amphetamin-positiver Mekoniumproben beitragen. Mekoniumproben wurden zunächst mit der Enzym-multiplizierten Immunoassay-Technik (EMIT) bei einem Amphetamin-Cutoff von 500 ng / g gescreent. Wenn die Ergebnisse positiv waren, wurde das Vorhandensein von MAMP und Amphetamin (AMP) durch GC-MS bestätigt. Es ist möglich, dass einige Mekoniumproben MAMP- und / oder AMP-Biomarker in Konzentrationen unterhalb des Immunoassay-Cutoffs enthielten. Durch die direkte Analyse dieser Proben mit einem chromatographischen Verfahren mit verbesserten Nachweisgrenzen konnten wir die Prävalenz falsch negativer Immunoassay-Ergebnisse innerhalb der IDEALEN Population abschätzen.

Schließlich wurden fast 70% der positiven Ergebnisse bei Amphetamin-Screenings nicht bestätigt. EMIT-Assays, die auf MAMP / AMP abzielen, reagieren mit anderen sympathomimetischen Aminen, einschließlich rezeptfreier Kältemedikamentenkomponenten, Phenethylaminen und anderen illegalen Amphetaminen. Darüber hinaus können endogene Substanzen, andere exogene Verbindungen oder geringfügige MAMP / AMP-Metaboliten in Mekonium positive Immunoassay-Ergebnisse liefern. Frühere Forschungen zu Kokain und Cannabinoiden identifizierten relativ geringe Stoffwechselprodukte für Erwachsene, die in Mekonium in höheren Anteilen vorkommen und in Immunoassays deutlich kreuzreagieren (7, 8).

Ein schlechter Nachweis der MAMP-Exposition veranlasste unser Labor, 3 mögliche alternative Mekonium-Biomarker der pränatalen MAMP-Exposition zu untersuchen: p-Hydroxymethamphetamin (POHAMP), p-Hydroxyamphetamin (pOHAMP) und Norephedrin (NOREPH) (Abb. 1). pOHMAMP und NOREPH wurden in 86, 0% bzw. 25, 6% der MAMP-positiven Mekoniumproben gefunden, die nicht im Rahmen der IDEAL-Studie entnommen wurden; die pOHAMP-Konzentration lag immer unterhalb der Quantifizierungsgrenze (LOQ) (9). Es war jedoch noch nicht klar, ob diese neuartigen Biomarker die Identifizierung von MAMP-exponierten Säuglingen erhöhen würden, wenn MAMP und AMP nicht vorhanden waren. Das primäre Ziel dieser Studie war es festzustellen, ob die neuen MAMP-Metaboliten pOHMAMP, pOHAMP und NOREPH die Identifizierung von MAMP- und AMP-exponierten Neugeborenen verbessern könnten.

Stoffwechselweg von MAMP, AMP, NOREPH, pOHAMP und POHAMP.

Eine detaillierte Beschreibung der IDEAL-Studie wurde bereits veröffentlicht (10); Das Institutional Review Board jedes Standorts genehmigte die Studie. Nach der Bereitstellung informiert, schriftliche Zustimmung, Mütter wurden über die Menge und Häufigkeit von MAMP interviewt, Ecstasy (3,4-Methylendioxymethamphetamin, oder MDMA), und AMP-Konsum während der Schwangerschaft.

Mekonium wurde aus Windeln bis zum Auftreten von Milchstuhl gesammelt. Die Proben blieben bis zum Transport über Nacht zu den United States Drug Testing Laboratories (in Des Plaines, IL) zur Analyse gekühlt. Syva EMIT II Plus (Dade Behring / Siemens Healthcare Diagnostics) Screens für Urin-Amphetamin-Tests wurden für Mekoniumproben verwendet, nachdem sie einer Methanolhomogenisierung und Festphasenextraktion unterzogen worden waren. Wenn die Proben Screening-Ergebnisse ≥500 ng / g aufwiesen, bestätigte die GC-MS-Analyse das Vorhandensein von MAMP und AMP (5-ng / g-Cutoff). Alle Proben wurden bei -20 ° C eingefroren.

Nach der Analyse wurden Mekoniumproben zur weiteren Bewertung an das Nationale Institut für Drogenmissbrauch eingefroren. Mekoniumproben aus 3 IDEALEN Teilnehmergruppen wurden ausgewählt: (a) 48 Frauen, die den Konsum von Amphetaminen leugneten und dennoch positive Ergebnisse im Mekoniumscreening aufwiesen; (b) 62 Frauen, die selbst über den Konsum von Amphetaminen berichteten, hatten jedoch negative Ergebnisse im Mekoniumscreening; und (c) 22 Frauen, die selbst über den Konsum von Amphetaminen berichteten und positive Ergebnisse im Mekoniumscreening hatten. Die Reanalyse umfasste Methanolhomogenisierung, Festphasenextraktion und Flüssigkeitschromatographie-Tandem–Massenspektrometrie (LC-MS / MS) -Analyse (11, 12). Die ersten 72 Proben wurden auf MAMP, AMP, POHAMP, pOHAMP und NOREPH analysiert; ein 12.5-ng / g LOQ-Cutoff wurde verwendet, mit Ausnahme von pOHMAMP, für das ein 8-ng / g-Cutoff verwendet wurde (11). Die restlichen 60 Proben wurden mit einem LC-MS / MS-Verfahren mit niedrigeren LOQs für MAMP (2,5 ng / g), AMP (5 ng / g) und POHAMP (1 ng / g) analysiert (12); pOHAMP und NOREPH wurden aufgrund ihrer geringen Prävalenz im Ausgangsdatensatz ausgeschlossen.

Zur Datenanalyse und statistischen Auswertung wurden SPSS Version 16.0 für Windows (SPSS) und Microsoft Excel verwendet. P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Von den 132 Mekoniumproben, 43 (32.6%) enthielten einen oder mehrere MAMP-Biomarker durch LC-MS/MS-Analyse. Die meisten positiv getesteten Proben (62,7%) enthielten MAMP, AMP und pOHMAMP; MAMP und AMP wurden nur in 16,3% der Proben gefunden. MAMP und pOHMAMP wurden in 4,7% identifiziert, und MAMP wurde nur in 2,3% beobachtet. Überraschenderweise waren 6 (14,0%) von 43 Proben positiv für pOHMAMP ohne positive Ergebnisse für MAMP oder AMP. pOHAMP und NOREPH wurden in wenigen Proben und nur dann identifiziert, wenn auch MAMP und AMP vorhanden waren.

Die 48 Frauen, die den Konsum von Amphetaminen während der Schwangerschaft ablehnten, hatten Mekoniumproben, die als positiv eingestuft wurden. Die Ergebnisse für die meisten Mekoniumproben wurden in der LC-MS / MS-Reanalyse nicht bestätigt; Nur 2 Proben enthielten MAMP, AMP und / oder pOHMAMP, einschließlich 1 Probe mit 6,2 ng / g MAMP (Tabelle 1). Wir bewerteten Mekoniumproben von Neugeborenen von 62 Frauen, die über den Konsum von Amphetaminen während der Schwangerschaft berichteten, aber die Mekoniumproben ihrer Säuglinge wurden als negativ bewertet; 48 dieser Frauen stoppten den Amphetaminkonsum im ersten oder zweiten Trimester (frühe Exposition), während die restlichen 14 Frauen den Missbrauch bis ins dritte Trimester fortsetzten (späte Exposition). Zwanzig (32.3%) der 62 Mekoniumproben enthielten einen oder mehrere Biomarker, die den LC-MS / MS-LOQ überschritten, einschließlich 6 Proben nur mit pOHMAMP (Tabelle 1). Diese 6 Proben stammten von 2 Frauen, die im ersten und / oder zweiten Trimester Amphetamine konsumierten, und von 4 Frauen, die ihre Einnahme bis ins dritte Trimester fortsetzten. MAMP-, AMP- und pOHMAMP-Einzel- und Gesamtbiomarkerkonzentrationen durch LC-MS / MS-Analyse lagen in 59 (95,2%) von 62 Mekoniumproben unter dem Immunoassay-Cutoff, einschließlich aller Proben von Neugeborenen, die zu Beginn der Schwangerschaft exponiert waren. Unter den 22 Frauen mit positivem Selbstbericht und positiven Mekonium-Screening-Ergebnissen wurden die Ergebnisse aller Mekoniumproben bis auf 1 sowohl durch GC-MS als auch durch LC-MS / MS bestätigt (Tabelle 1).

Tabelle 1

Prävalenz und Konzentrationen von Amphetaminen und Metaboliten in Mekonium, bestimmt durch LC-MS/MS.

Analysierte Proben, n Positiv, n (%) Median, ng/g Bereich, ng/g
Negativer mütterlicher Selbstbericht und positives Ergebnis im Immunoassay-Bildschirm (n = 48)
MAMP 48 2 (4.2) 2479 6.2–4952
AMP 48 1 (2.1) 1106
pOHMAMP 48 1 (2.1) 28.9
pOHAMP 19 0 (0.0)
NOREPH 19 1 (5.3) 31.4
Positiver mütterlicher Selbstbericht und negatives Ergebnis im Immunoassay-Bildschirm (n = 62)
MAMP 62 14 (22.6) 29.3 5.1–10370
AMP 62 12 (19.4) 23.1 5.1–1600
pOHMAMP 62 15 (24.2) 23.0 1.3–435
pOHAMP 34 1 (2.9) 17.1
NOREPH 34 2 (5.9) 26.8 13.7–39.9
Positiver mütterlicher Selbstbericht und positives Ergebnis im Immunoassay-Bildschirm (n = 22)
MAMP 22 21 (95.5) 1455 188-10250
AMP 22 21 (95.5) 285 20.3-1012
pOHMAMP 22 19 (86.4) 140 27.2–402
pOHAMP 19 0
NOREPH 19 8 (42.1) 17.0 14.2–96.9

Wir verglichen das Vorhandensein von pOHMAMP und seine Konzentrationen in Mekoniumproben mit mütterlichen Mustern des MAMP-Gebrauchs und dem geschätzten Gestationsalter, um Faktoren zu untersuchen, die möglicherweise die pOHMAMP-Disposition beeinflussen. pOHMAMP wurde häufiger identifiziert und trat bei höheren Konzentrationen (median 138 ng / g; Bereich 3,5–345 ng / g) auf, wenn die Exposition bis ins dritte Trimester anhielt (23 von 34 Neugeborenen, 67,6%), als wenn der Drogenkonsum früher eingestellt wurde (11 von 50 Neugeborenen, 22,0%; Median 23,0 ng / g; Bereich 1,2–343 ng / g). Die Expositionshäufigkeit hing nicht mit dem Vorhandensein oder der Konzentration von pOHMAMP zusammen. Ein jüngeres Alter der Mutter und ein verringertes Geburtsgewicht waren mit dem Vorhandensein von pOHMAMP assoziiert, korrelierten jedoch nicht linear mit den Konzentrationen in Mekonium; ähnliche Ergebnisse wurden für MAMP und AMP beobachtet (siehe Tabelle 1 in der Datenergänzung, die der Online-Version dieser kurzen Mitteilung bei http://www.clinchem.org/content/vol56/issue5 beiliegt).

Die Überwachung von pOHAMP und NOREPH erhöhte die Identifizierung betroffener Säuglinge nicht; Diese Analyten wurden nur in Verbindung mit MAMP und AMP gefunden. Sechs weitere Neugeborene, von denen alle negative Screening-Ergebnisse hatten, wurden jedoch nur durch pOHMAMP-Anwesenheit in Mekonium identifiziert. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Identität anderer Immunoassay-reaktiver Biomarker zu bestimmen und die Kreuzreaktivität des Immunoassays mit anderen endogenen und exogenen Analyten zu verringern. In: Moore et al. identifizierte einen großen Teil der Mekoniumproben, die im Amphetamin-Immunoassay positiv getestet wurden, als positiv für Pseudoephedrin oder Phenylethylamin (13).

Fast 1 von 3 Neugeborenen mit mütterlicher selbstberichteter MAMP-Anwendung, aber Immunoassay-negativen Mekonium-Ergebnissen, hatte positive LC-MS / MS-Ergebnisse, obwohl die meisten Konzentrationen niedrig waren. Eine Verringerung der Immunoassay-Cutoff-Konzentration hätte möglicherweise mehr true-positive Proben identifiziert, aber angesichts der bereits niedrigen Bestätigungsrate hätte sie wahrscheinlich auch zusätzliche unbestätigte Proben identifiziert. In: Marin et al. direkter Vergleich des EMIT-Assays (200-ng/g Cutoff) mit einem ELISA (20-ng/g Cutoff) (14). Trotz des niedrigeren ELISA-Cutoffs zeigten beide Immunoassays im Vergleich zu den Ergebnissen chromatographischer Bestätigungstests gleichwertige falsch-positive Raten. In Fällen von MAMP-Missbrauch, der von der Mutter selbst gemeldet wurde, kann es ratsam sein, chromatographische Tests direkt durchzuführen oder Neugeborene aufgrund positiver Ergebnisse in Mekoniumtests oder im mütterlichen Selbstbericht in die MAMP-exponierte Gruppe aufzunehmen, wie dies in der IDEAL-Studie der Fall war.

pOHMAMP war häufiger vorhanden, wenn der Konsum von mütterlichen Amphetaminen bis ins dritte Trimester anhielt, aber sein Vorhandensein wurde nicht durch die Häufigkeit des MAMP-Konsums beeinflusst. Es ist noch nicht klar, welche anderen Faktoren zur Bildung und / oder Disposition von pOHMAMP beitragen können. MAMP wird durch CYP2D6 in AMP und pOHMAMP biotransformiert (15), das > 70 allelische Varianten aufweist (16) und erhöhte Aktivität während der Schwangerschaft (17); Die Pharmakogenomik der Teilnehmer ist unbekannt. Im Urin überwiegen unveränderte MAMP-, AMP- und pOHMAMP-Konzentrationen (18, 19), ähnlich wie bei Mekonium. Fetale Leber produziert CYP2D6 früh in der Schwangerschaft (20), aber seine metabolische Effizienz für MAMP ist unbekannt. Zusätzliche Studien sind notwendig, um zu klären, welche Faktoren die Biomarkerdisposition in Mekonium beeinflussen.

Zusammenfassend identifizierte pOHMAMP allein zusätzliche Amphetamin-exponierte Neugeborene, während pOHAMP und NOREPH dies nicht taten. Bestätigungsraten von Amphetaminen Immunoassay-positivem Mekonium nahmen nicht zu. Weitere Forschung ist notwendig, um kreuzreaktive Spezies zu identifizieren, die zu unbestätigten positiven Ergebnissen in Immunoassays von Mekonium beitragen.